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“線粒體功能障礙+乳酸化+細胞衰老”輕松拿下Eur Heart J

更新時間:2024-11-19      點擊次數:2604

動脈粥樣硬化與衰老密切相關,是全球主要的死亡原因之一。越來越多的證據表明,血管平滑肌細胞(VSMC)的衰老在動脈粥樣硬化的形成中發揮重要作用。


VSMC的衰老不僅導致其數量減少,還影響了斑塊破裂后的修復能力,進而增加斑塊的脆弱性。因此,深入探討VSMC衰老的新機制并尋找新的治療靶點是推動動脈粥樣硬化治療的重要方向。


細胞衰老通常是由多種因素引發的應激反應,導致細胞不可逆地停止生長。衰老細胞會釋放出多種生物活性物質,稱為衰老相關分泌表型(SASP),這些物質破壞了組織微環境,并引發衰老相關的炎癥反應。關于SASP在VSMC衰老及動脈粥樣硬化中的表觀遺傳調控仍存在明顯的研究空白。


衰老的VSMC經歷了從線粒體氧化磷酸化到有氧糖酵解的代謝轉變,這種轉變導致乳酸的積累。乳酸不僅是能量代謝的重要調節劑,其過高的水平還被認為與多種疾病的發展相關。因此,揭示乳酸及其代謝產物對衰老和動脈粥樣硬化的影響,將為理解這一疾病提供新視角。


腫瘤壞死因子受體相關蛋白1(TRAP1)是熱休克蛋白家族的重要成員,參與細胞的代謝和穩態調節。已有研究表明,線粒體基因TRAP1在調控乳酸積累方面發揮著作用,并與衰老相關疾病密切相關,但其在動脈粥樣硬化中的具體功能尚未被充分探索。


本研究全面探討TRAP1在VSMC衰老和動脈粥樣硬化中的作用。研究證明HDAC3是調節血管平滑肌細胞(VSMC)衰老中H4K12la的重要因子,促進SASP表達并加速細胞衰老,同時闡明了能量代謝與表觀遺傳功能的聯系,為衰老相關疾病(如動脈粥樣硬化)的治療提供了新見解與策略。



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相關研究由南京醫科大學藥學院團隊于2024年8月1日發表在心血管頂級期刊European Heart Journal (歐洲心臟病學雜志,IF=37.6) 。具體研究思路解析如下:






 TRAP1調節VSMC衰老





研究目標:旨在探討線粒體基因TRAP1在血管平滑肌細胞(VSMC)衰老中的作用,特別是在動脈粥樣硬化和高脂飲食條件下TRAP1的表達如何影響細胞衰老過程。


方法步驟:


(1)數據庫整合與基因篩選:研究者整合了衰老相關數據庫和MitoMiner數據庫,發現在Ras誘導的人VSMC中TRAP1顯著上調,提示其可能與衰老相關。


(2)樣本分析:對動脈粥樣硬化患者和高脂飲食喂養的ApoeKO小鼠的主動脈組織進行分析,結果顯示TRAP1及衰老標志物(如P53、P21、P16)的表達水平升高,表明TRAP1與VSMC衰老相關。


(3)免疫熒光染色:通過免疫熒光染色觀察TRAP1與血管平滑肌細胞標記物α-SMA的共定位,進一步確認TRAP1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達。


(4)TRAP1敲低:進行TRAP1敲低實驗,發現TRAP1的缺失可以顯著降低Ras誘導的衰老標志物,并改善線粒體功能和能量代謝。


(5)TRAP1過表達:過表達TRAP1的細胞實驗顯示,TRAP1過表達會顯著促進VSMC的衰老,提示TRAP1在細胞衰老中的促效應。


(6)衰老特征評估:評估VSMC衰老的特征,包括表型轉變(收縮表型相關基因表達下降,合成表型相關基因表達上升)、SA-β-Gal陽性細胞的數量以及細胞增殖能力的變化。


(7)SASP分析:研究TRAP1對衰老相關分泌表型(SASP)的影響,發現TRAP1沉默顯著降低了SASP的上調。


結果總結:證實TRAP1作為一種與衰老相關的線粒體基因,對VSMC的衰老具有積極促進作用。TRAP1的表達水平與動脈粥樣硬化和細胞衰老密切相關,其缺失可改善線粒體功能并延緩衰老過程,而過表達則加速衰老。這些發現為理解細胞衰老機制提供了新的視角,并可能為相關疾病的治療提供潛在的靶點。


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圖1 TRAP1調節VSMC衰老





TRAP1是衰老VSMC中能量重編程的關鍵調節因子


研究目標:探索TRAP1在Ras誘導的人血管平滑肌細胞(VSMC)中的作用,特別是其如何影響線粒體功能和能量代謝。


實驗設計:


(1)缺失TRAP1的影響:比較TRAP1缺失與正常情況對于線粒體損傷及代謝變化的影響,采用線粒體染色與Seahorse實驗測定線粒體功能和糖酵解活性。


(2)代謝產物的檢測:評估缺失TRAP1后,乙酰輔酶A和檸檬酸的水平,分析能量代謝的轉變趨勢。


(3)關鍵酶的表達檢測:

通過Western blot和qPCR檢測糖酵解限速酶(如PFK1、HK2、PKM2)以及參與三羧酸循環(TCA)和電子傳遞鏈的酶的表達與活性。觀察TRAP1缺失是否上調PFK1的表達,并分析這種變化對其他代謝途徑的影響。


(4)相互作用分析:

使用共免疫沉淀(CoIP)等技術驗證TRAP1與PFK1之間的相互作用。檢測TRAP1對PFK1泛素化水平的影響,分析其如何通過降低泛素化促進PFK1表達。


(5)干預實驗:


通過使用TRAP1抑制劑G-TPP和小干擾RNA(siRNA)靶向TRAP1,觀察對VSMC代謝的影響。檢測PFK1抑制劑對TRAP1過表達VSMC中線粒體功能的改善作用。


結果分析:TRAP1缺失能改善Ras誘導的VSMC線粒體損傷,減少能量代謝對糖酵解的傾斜,同時提高氧化磷酸化水平。PFK1的過表達對電子傳遞鏈的活性產生抑制作用,TRAP1通過與PFK1相互作用,在調節糖酵解途徑上發揮關鍵作用。


結論:TRAP1通過上調PFK1的表達,抑制TCA循環和電子傳遞鏈活性,從而影響VSMC的能量代謝。這一發現強調了TRAP1在衰老和動脈粥樣硬化中的重要角色,為未來治療策略的開發提供了新的視角。


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圖2 TRAP1是衰老VSMC中能量重編程的關鍵調節因子






TRAP1介導的乳酸積累促進VSMC衰老


研究背景:研究關注TRAP1在衰老人血管平滑肌細胞(VSMC)中對乳酸生產的影響,以及乳酸在細胞衰老中的作用。


實驗目標:


(1)確定TRAP1敲低對VSMC中乳酸水平的影響。

(2)測試外源性補充乳酸是否能夠逆轉TRAP1敲低所引起的細胞衰老。


實驗設計:


(1)TRAP1敲低:通過小干擾RNA(siRNA)靶向TRAP1,觀察衰老VSMC中的乳酸產量變化,使用Seahorse實驗測定細胞的代謝功能,并通過Western blot(WB)和SA-β-Gal染色來評估細胞衰老和相關標志物的表達。


(2)外源性乳酸補充在TRAP1敲低后補充外源性乳酸,檢測其對細胞衰老指標的影響。


(3)乳酸抑制實驗:使用糖酵解抑制劑2-DG、乳酸脫氫酶抑制劑和針對乳酸脫氫酶的siRNA來降低乳酸產生,觀察這些處理對VSMC衰老的影響。


結果分析:


(1)發現TRAP1敲低確實降低了衰老VSMC中的乳酸產量,同時補充乳酸可以逆轉TRAP1敲低引起的衰老現象,包括衰老標志物的減少和細胞增殖能力的提升。


(2)糖酵解抑制劑和乳酸脫氫酶的抑制也顯著降低了乳酸水平,并減輕了VSMC的衰老表現,進一步支持乳酸積累與TRAP1誘導衰老之間的關系。


結論:研究結果支持TRAP1通過增加乳酸積累來促進VSMC衰老的假設,說明乳酸作為關鍵代謝物在細胞衰老中的重要性。


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圖3 TRAP1介導的乳酸積累促進VSMC衰老



TRAP1介導H4K12la促進衰老VSMC中SASP激活



研究背景:本研究探討TRAP1介導的乳酸積累如何通過組蛋白H4K12乳酸化(H4K12la)促進衰老的血管平滑肌細胞(VSMC)中衰老相關分泌表型(SASP)的激活。


實驗設計:


(1)TRAP1敲低:通過敲低TRAP1,觀察Ras誘導的人VSMCs中整體蛋白乳酸化(特別是H4K12la)水平的變化,主要借助Western blot分析。


(2)H4K12la定位:使用超分辨率熒光成像觀察H4K12la在衰老VSMCs中的定位,尤其是在核膜的富集情況。


(3)外源乳酸補充:補充乳酸以檢測其是否能恢復TRAP1敲低后H4K12la水平的變化。


(4)驗證H4K12la與SASP的關系:

通過ChIP-qPCR和核跑膠實驗確認H4K12la在SASP啟動子區域的富集,進而分析H4K12la對SASP轉錄的影響。


(5)HDAC3的作用:

研究HDAC3在調節H4K12la和SASP中的作用,評估p300和HDAC1-3的催化功能,特別觀察HDAC3在Ras誘導的hVSMC中的表達變化。驗證乳酸如何影響HDAC3的表達,并通過Western blot和免疫熒光染色確認其對H4K12la水平的影響。


(6)干預實驗:

過表達HDAC3以評估其對H4K12la、衰老標志物和SASP表達的影響,使用轉錄技術檢測新生SASP轉錄物的變化。


(7)HDAC激動劑的實驗:

使用HDAC激動劑ITSA-1進一步驗證HDAC3在H4K12la介導的衰老中的作用,觀察其對H4K12la和SASP轉錄的影響。


研究結論:乳酸通過下調HDAC3表達,增加H4K12la水平,進而促進VSMC的衰老和SASP的激活。這一機制提供了TRAP1在細胞衰老中的新見解,強調了乳酸和表觀遺傳修飾在衰老過程中的重要性。



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圖4 TRAP1介導H4K12la促進衰老VSMC中SASP激活



阻斷 HDAC3 上調 H4K12la 促進 VSMC 衰老


本研究旨在探討HDAC3在Ras誘導的衰老VSMCs中的作用,以及乳酸如何通過調節HDAC3表達來影響VSMC衰老和SASP(衰老相關分泌表型)的表達。


實驗目標:

確定Ras誘導的VSMCs中HDAC3的表達變化。

探究TRAP1敲低或乳酸如何影響HDAC3的表達。

評估HDAC3過表達對VSMC衰老及SASP表達的影響。

驗證HDAC3激動劑ITSA-1在抑制H4K12乳酸化和衰老方面的作用。


實驗設計:

Western blot分析:檢測Ras誘導的VSMCs中HDAC3的表達變化。過表達實驗:通過過表達HDAC3來觀察其對VSMC衰老及SASP表達的影響。


抑制劑實驗:使用HDAC3激動劑ITSA-1來驗證其對H4K12乳酸化和衰老的影響。


染色質免疫沉淀(ChIP)實驗:檢測H4K12乳酸化在SASP啟動子處的富集情況。


關鍵步驟:


HDAC3表達檢測:通過Western blot分析發現Ras誘導的VSMCs中HDAC3蛋白表達顯著下調。


TRAP1和乳酸的影響:TRAP1敲低或添加乳酸可以進一步下HDAC3的表達


HDAC3過表達實驗:通過過表達HDAC3,發現其可以顯著減H4K12乳酸化,降低衰老標志物和SASP的表達,恢復細胞增殖能力。


HDAC3激動劑實驗:使用HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。


ChIP實驗:驗證HDAC3過表達對SASP啟動子處H4K12乳酸化和相關組蛋白修飾的影響。


結果分析:


Ras誘導的VSMCs中HDAC3表達顯著下降。


TRAP1敲低或添加乳酸可以進一步下調HDAC3的表達。


HDAC3過表達可以顯著減少H4K12乳酸化,降低衰老標志物和SASP的表達,恢復細胞增殖能力。


HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。


ChIP實驗顯示,HDAC3過表達顯著降低SASP啟動子處H4K12乳酸化和相關組蛋白修飾的水平。


結論:


(1)乳酸通過抑制HDAC3的表達來增加H4K12乳酸化,從而促進VSMC衰老。


(2)HDAC3的過表達可以減少H4K12乳酸化,降低衰老標志物和SASP的表達,恢復細胞增殖能力。


(3) HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加,支持HDAC3在VSMC衰老中的關鍵作用。


通過這些實驗,揭示了HDAC3在VSMC衰老和SASP表達中的重要作用,為治療衰老相關疾病提供了新的靶點和策略。


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圖5通過阻斷 HDAC3 上調 H4K12la 可促進 VSMC 衰老



SMC特異性Trap1敲除可改善動脈粥樣硬化


研究目標:探索SMC特異性TRAP1敲除在高脂飲食(HFD)喂養的Apoe KO小鼠中對主動脈動脈粥樣硬化(AS)的影響,包括斑塊面積、穩定性、衰老VSMC數量、H4K12乳酸化、能量代謝和SASP表達等。


實驗設計:


小鼠模型:使用Apoe KO小鼠建立SMC特異性Trap1敲除小鼠(Apoe KO Trap1 SMCKO),并喂養它們正常飼料(NC)或高脂飲食(HFD),持續16周。


斑塊分析:采用Oil Red O染色觀察主動脈中的脂質斑塊面積和穩定性,通過免疫組織化學染色進一步評估斑塊的穩定性。


衰老和能量代謝檢查:通過免疫熒光染色和Western blot分析衰老標志物(如P21)和H4K12乳酸化的表達,同時評估SASP因子和細胞能量代謝的變化。


關鍵步驟:


斑塊面積測定:比較HFD喂養的Apoe KO Trap1 WT與Trap1 SMCKO小鼠,觀察主動脈斑塊面積的變化。

衰老及乳酸化水平評估:使用P21和α-SMA的免疫熒光染色確認VSMC衰老,同時檢測H4K12乳酸化水平。

分化狀態及表型分析:評估在HFD喂養下VSMC的收縮表型與合成表型基因的表達變化。


結果分析:


斑塊面積和穩定性:發現Trap1敲除小鼠中的斑塊面積顯著減少,且斑塊更穩定。

衰老VSMC的減少:Trap1 SMCKO小鼠中衰老VSMC數量減少,H4K12乳酸化水平顯著降低,表明TRAP1在VSMC衰老中扮演重要角色。

能量代謝與SASP的改善:Trap1敲除導致乳酸產生和SASP表達顯著下降,說明VSMC的能量代謝得到改善。


結論:


(1)TRAP1通過增加H4K12乳酸化來促使VSMC衰老,從而推動動脈粥樣硬化的發展。

(2)SMC特異性Trap1敲除能夠顯著降低斑塊面積、增強斑塊穩定性,并改善VSMC的代謝狀態及衰老特征,提示TRAP1可能是動脈粥樣硬化治療的新靶點。


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圖6 SMC 特異性Trap1敲除可改善動脈粥樣硬化



TRAP1 的藥理學抑制可抑制體內動脈粥樣硬化發展



研究目標:探討TRAP1抑制劑G-TPP在高脂飲食(HFD)喂養的Apoe KO小鼠中對主動脈動脈粥樣硬化(AS)發展的影響,包括斑塊面積、壞死核心大小和膠原含量的變化。


實驗設計:


小鼠模型:將HFD喂養的Apoe KO小鼠分為G-TPP處理組與對照組。毒性和代謝參數監測:在給予G-TPP后,監測小鼠的代謝參數確保不會對其代謝造成負面影響。

斑塊分析:通過油紅O染色、Masson染色、Sirius Red染色和H&E染色來評估主動脈斑塊面積、壞死核心大小及膠原含量。

衰老標志物檢測:使用免疫熒光染色和Western blot分析P21、H4K12乳酸化(H4K12la)信號和SASP因子的表達。


關鍵步驟:


斑塊和膠原分析:比較G-TPP處理組與對照組小鼠主動脈的斑塊特征,包括面積、壞死核心大小及膠原含量。

衰老與乳酸化水平測定:觀察G-TPP處理是否能顯著降低VSMC中的P21和H4K12la水平,并評估MOVAS細胞中的衰老標志物和SASP的表達。


結果分析:


斑塊改善:G-TPP處理顯著降低了HFD喂養的Apoe KO小鼠的主動脈斑塊面積和壞死核心大小,同時增加了膠原含量,表明動脈粥樣硬化得到了改善。

衰老標志物的變化:在G-TPP治療后,免疫熒光和Western blot分析顯示小鼠主動脈中的P21和H4K12la信號顯著降低,表明VSMC的衰老程度減輕。

SASP的降低:G-TPP處理降低了MOVAS細胞中的SASP因子的表達,進一步支持了TRAP1抑制對衰老和炎癥反應的影響。


結論:


使用TRAP1抑制劑G-TPP可以有效減緩HFD誘導的動脈粥樣硬化發展,通過降低斑塊尺寸、增加膠原含量及減少VSMC的衰老標志物,建立了TRAP1作為動脈粥樣硬化治療的新靶點。這些結果表明,抑制TRAP1可能是一種有前景的動脈粥樣硬化治療策略,值得在未來進行更深入的研究和臨床應用探索。


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圖7 TRAP1 的藥理學抑制可抑制體內動脈粥樣硬化發展



通過 PROTAC 降解 TRAP1 治療動脈粥樣硬化


研究目標:探討通過PROTAC技術降解TRAP1作為治療動脈粥樣硬化的新策略,相較于傳統抑制劑,靶向蛋白降解具有更高的療效和特異性。


實驗設計:


(1)候選化合物:識別小分子化合物16b(BP3),該化合物能夠促使TRAP1通過泛素化機制降解,依賴于cereblon(CRBN)。

(2)TRAP1降解實驗:通過Western blot分析評估BP3對TRAP1蛋白的降解效果,觀察在不同濃度下TRAP1的變化。

(3)評估細胞毒性:實施初步毒性評估,確認BP3在高濃度下對細胞的毒性有限,確保其應用安全。

(4)體內實驗:

小鼠模型:在高脂飲食(HFD)條件下對ApoeKO小鼠進行BP3治療,分析其對斑塊面積、壞死核心和膠原蛋白含量的影響。

生理參數監測:監測小鼠在治療前后的體重、血壓和血脂,確保BP3對這些生理參數沒有顯著影響。


實驗結果:BP3能夠有效誘導TRAP1的降解,顯著減少VSMC的衰老和動脈粥樣硬化的相關病變;BP3治療后,小鼠主動脈中的斑塊面積和壞死核心顯著減少,并且膠原含量增加,顯示出動脈粥樣硬化的改善;還發現BP3處理降低了相關衰老標志物、H4K12la和SASP的表達,體現出TRAP1的降解效果。


結論:通過BP3降解TRAP1,顯示出其作為動脈粥樣硬化治療的新方式的潛力。這一研究結果為未來的臨床應用提供了實驗基礎。


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圖8 通過 PROTAC 降解 TRAP1 治療動脈粥樣硬化




機制探討



本研究發現線粒體蛋白TRAP1在血管平滑肌細胞(VSMC)衰老及動脈粥樣硬化中起重要作用,誘導組蛋白微環境變化并促進衰老進程。


TRAP1的上調促進糖酵解,導致乳酸積累。積累的乳酸通過抑制組蛋白賴氨酸去乙酰化酶HDAC3,增強H4K12乳酸化(H4K12la),從而促進衰老相關分泌表型(SASP)轉錄,加劇動脈粥樣硬化。這一機制揭示了細胞代謝與表觀遺傳調控之間的相互作用,為TRAP1作為潛在治療靶點提供了依據。


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TRAP1的作用:TRAP1是線粒體功能的重要調節因子,其基因敲除小鼠在與年齡相關的疾病中表現出的發病率降低。此研究中,TRAP1在衰老VSMC中的過表達導致糖酵解上調,從而影響能量代謝。


組蛋白乳酸化的作用:組蛋白乳酸化在多種生物過程中發揮重要作用,并在與衰老相關的SASP激活中起關鍵角色。本研究強調H4K12la在衰老特異性染色質微環境的構建中的作用。


HDAC3作為關鍵因子:HDAC3被確定為調節H4K12la的重要酶,它的抑制導致H4K12la水平升高,SASP增強,進而促進VSMC衰老,為動脈粥樣硬化的治療提供了新的靶點。


代謝與表觀遺傳學的交互:研究揭示了乳酸代謝與組蛋白修飾之間的新聯系,表明代謝信號在衰老和動脈粥樣硬化中的重要性,提出代謝-表觀遺傳串擾的觀點,并引出對其他代謝中間體的研究。


細胞衰老對健康的影響:細胞衰老與多種疾病密切相關,包括心血管疾病,線粒體功能損傷和代謝異常在細胞衰老中起核心作用。本研究指出:


(1)衰老的VSMC中糖酵解水平升高,推動進一步探索細胞代謝重編程的機制;


(2)研究還指出腫瘤藥物(如他莫昔芬和TRAP1抑制劑G-TPP)在動脈粥樣硬化治療中的潛在應用,強調了重新利用抗腫瘤藥物來應對衰老驅動的心血管疾病的可能性;


(3)PROTAC BP3作為新型藥物,能夠高效誘導TRAP1降解,顯示出治療動脈粥樣硬化的潛力,并具備較高的選擇性和較低的細胞毒性。


局限性與未來研究方向:盡管乳酸對HDAC3的抑制影響明顯,但其具體機制仍需進一步研究,未來在細胞代謝與表觀遺傳學交互方面的研究仍有廣闊空間。


參考文獻:

[1] Li X, et al. TRAP1 drives smooth muscle cell senescence and promotes atherosclerosis via HDAC3-primed histone H4 lysine 12 lactylation. Eur Heart J. 2024 Aug. 
doi:10.1093/eurheartj/ehae379



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