一、TALENs技術(shù)原理與核心突破

（一）結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與作用機(jī)制

TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）是一種人工工程化核酸酶，由兩部分構(gòu)成：

1. DNA識(shí)別域（TALE蛋白）：

• 由 34個(gè)氨基酸的重復(fù)單元 組成，每個(gè)單元通過(guò) 第12、13位的可變氨基酸（RVDs） 特異性識(shí)別單個(gè)堿基：

• 識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為 15-20 bp，確保靶向wei一性。

2. DNA切割域（FokI核酸酶）：

• 需形成二聚體才能切割DNA，因此TALENs需成對(duì)設(shè)計(jì)（左右臂），切割位點(diǎn)位于兩臂之間（間隔區(qū)通常為12-20 bp）。

（二）基因編輯機(jī)制

1. 雙鏈斷裂（DSB）：

• TALE結(jié)合靶序列 → FokI二聚化 → 切割DNA雙鏈。

2. 修復(fù)路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：隨機(jī)插入/缺失（Indels），導(dǎo)致基因敲除。

• 同源定向修復(fù)（HDR） ：需提供外源修復(fù)模板，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)插入或點(diǎn)突變。

技術(shù)突破：shu次實(shí)現(xiàn)任意基因組位點(diǎn)的精準(zhǔn)切割，且脫靶率低于早期ZFN技術(shù)。

二、TALENs動(dòng)物模型構(gòu)建流程

（一）標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟

（二）關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)化

• 6模塊串聯(lián)（+63架構(gòu)）

• 酶切連接（BsaI/BsmBI） | 6天內(nèi)完成構(gòu)建，效率提升5倍 |
  | 表達(dá)載體 | 哺乳動(dòng)物雙啟動(dòng)子載體（CMV/T7），支持細(xì)胞轉(zhuǎn)染與mRNA合成 | 適配多物種應(yīng)用（斑馬魚、小鼠、人iPS細(xì)胞） |
  | 活性驗(yàn)證 | 酵母單雜交系統(tǒng)或細(xì)胞報(bào)告基因檢測(cè) | 替代耗時(shí)ES細(xì)胞打靶，周期縮短至1周 |
  | 胚胎遞送 | 受精卵顯微注射：

• mRNA：TALENs體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

• RNP復(fù)合物：TALE-FokI蛋白復(fù)合體 | RNP減少脫靶效應(yīng)，提升安全性