一、技術(shù)原理與核心機(jī)制

ZFNs 是第一代可編程基因編輯工具，通過融合 DNA 結(jié)合域（鋅指蛋白）與 DNA 切割域（FokI 核酸酶）實(shí)現(xiàn)靶向編輯：

1. 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域：

• 由 30-34 個(gè)氨基酸重復(fù)單元構(gòu)成，每個(gè)單元通過 第 12、13 位可變殘基（RVDs） 識別特定堿基：

• 單個(gè)鋅指識別 3 bp，串聯(lián) 3-6 個(gè)可靶向 9-18 bp 序列。

2. FokI 切割域：

• 需 二聚化 才能激活切割功能 → ZFNs 需成對設(shè)計(jì)（左臂/右臂），切割位點(diǎn)位于兩臂結(jié)合位點(diǎn)之間（間隔區(qū) 5-7 bp）。

3. 編輯機(jī)制：

• 雙鏈斷裂（DSB）→ 細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：隨機(jī)插入/缺失（Indels），導(dǎo)致基因敲除。

• 同源定向修復(fù)（HDR） ：需外源修復(fù)模板（如 ssODN），實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變或基因插入。

技術(shù)突破：shou次實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物基因組靶向編輯（2005 年），開啟精準(zhǔn)基因編輯時(shí)代 。

二、動(dòng)物模型構(gòu)建流程與技術(shù)優(yōu)化

（一）標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟

（二）關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)優(yōu)化

• 3-6 個(gè)鋅指單元串聯(lián)

• Golden Gate 克隆（BsaI/BsmBI） | 6 天完成構(gòu)建，成功率 >80%  |
  | 表達(dá)載體 | 雙啟動(dòng)子載體（CMV/T7），支持 mRNA 合成與蛋白表達(dá) | 適配多物種（斑馬魚、小鼠、豬）  |
  | 遞送方式 | - 受精卵顯微注射 ZFNs mRNA

• 體細(xì)胞轉(zhuǎn)染 + 核移植（大型動(dòng)物） | mRNA 遞送減少脫靶  |
  | 修復(fù)增強(qiáng) | 聯(lián)合 ssODN 模板 + NHEJ 抑制劑（SCR7） | HDR 效率提升 3 倍  |

三、多物種應(yīng)用案例與模型優(yōu)勢

（一）典型物種與疾病模型

（二）不可替代性應(yīng)用場景

1. 高 GC 區(qū)域編輯：

• 無 PAM 序列限制，可靶向 CRISPR/Cas9 無法編輯的區(qū)域 。

2. 低脫靶率需求：

• 治療性編輯中脫靶率 <0.1%（CRISPR 為 1-10%）。

3. 大型動(dòng)物模型：

• 豬、牛等物種中免疫原性低于 CRISPR 。