各位讀者好，今天為大家解讀的文獻是由浙江大學邵逸夫醫(yī)院團隊、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院團隊、南京鼓樓醫(yī)院團隊聯(lián)合北京中日友好醫(yī)院團隊在Nature Communications發(fā)表的，題為“Unraveling the spatial organization and development of human thymocytes through integration of spatial transcriptomics and single-cell multi-omics profiling"。

人類胸腺細胞（thymocytes）的發(fā)育和空間組織是免疫學研究的重要領(lǐng)域，對于理解T細胞成熟和免疫功能至關(guān)重要。當前，研究者們主要通過流式細胞術(shù)和單細胞轉(zhuǎn)錄組分析來研究胸腺細胞的發(fā)育，但這些方法無法提供細胞的空間信息，限制了對胸腺微環(huán)境和細胞間相互作用的深入理解。

盡管單細胞多組學技術(shù)的發(fā)展為胸腺細胞的研究提供了新的視角，但如何將這些高維數(shù)據(jù)與細胞的空間位置信息相結(jié)合，仍是一個技術(shù)挑戰(zhàn)。此外，胸腺細胞發(fā)育過程中的細胞間通訊和微環(huán)境影響因素的識別也是研究中的難點，需要更精細的空間分辨率和多維度數(shù)據(jù)整合方法來克服。

本研究通過整合空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞多組學分析，深入探究了人胸腺細胞的空間組織和發(fā)育過程。研究揭示了T細胞發(fā)育、空間組織在單細胞分辨率下的動態(tài)變化，以及與T細胞成熟相關(guān)的TCR信號傳導(dǎo)變化，為理解基礎(chǔ)免疫機制和潛在的臨床應(yīng)用提供了寶貴的見解和數(shù)據(jù)資源。

空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞多組學結(jié)合應(yīng)用已在眾多研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。上海達為科可開展空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞多組學結(jié)果分析與解讀，進行相關(guān)分子對接、蛋白互作靶點預(yù)測，繼而開展后續(xù)相關(guān)研究。

Fig.1a研究設(shè)計示意圖

研究框架：

1.研究問題：

    文章旨在探索人類胸腺細胞的空間分布和發(fā)育軌跡，以及不同胸腺細胞亞群之間的相互作用。

2.研究方法：

    利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（ST）和單細胞測序技術(shù)對胸腺組織進行分析。

    采用CellChat工具評估胸腺細胞亞群間的相互作用。

    利用Seurat的AddModuleScore函數(shù)和Monocle2進行細胞亞群的相對距離評估和軌跡分析。

    應(yīng)用GO富集分析和擴散圖譜分析來探究T細胞亞群的功能和發(fā)育軌跡。

3.數(shù)據(jù)分析：

    對胸腺細胞的空間分布進行聚類和區(qū)域劃分，確定髓質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)域。

    通過廣義線性高斯模型分析細胞類型隨空間距離的變化。

    識別與空間距離顯著相關(guān)的基因（DVGs）。

4.結(jié)論：

    揭示了胸腺T細胞發(fā)育的基本結(jié)構(gòu)單元——胸腺小葉的精確分割。

    描述了不同T細胞亞群相對于髓質(zhì)中心的空間分布。

    通過GO分析和軌跡分析，深入理解了T細胞亞群的功能特性和發(fā)育路徑。

    文章通過綜合分析，為理解人類胸腺細胞的發(fā)育和功能提供了新的視角，并為胸腺相關(guān)疾病的研究提供了潛在的生物標志物。

結(jié)果解析：

研究者通過對16個不同發(fā)育階段的胸腺樣本包括產(chǎn)前（4個樣本）、兒童（8個樣本）、成人（2個樣本）和老年（2個樣本）階段進行單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，揭示了不同細胞亞群在胸腺中的發(fā)育軌跡。總結(jié)樣本信息后經(jīng)過質(zhì)量控制、整合、主成分分析（PCA）和無監(jiān)督聚類，利用典型標記，將聚集的細胞預(yù)先注釋為六大譜系，并對B細胞、髓系細胞、基質(zhì)細胞和T細胞進行第二輪聚類，共劃分為34種不同的細胞亞型。后續(xù)發(fā)現(xiàn)，未成熟的T細胞亞群，如雙陰性細胞（DN_early, DN_blast）與年齡呈拮抗關(guān)系，在產(chǎn)前階段最為豐富，而部分成熟的T細胞（如CD4+ T記憶細胞和調(diào)節(jié)性T細胞）在成人和老年群體中更為豐富。這些結(jié)果表明，胸腺的纖維化和老化影響了T細胞的發(fā)育，并與胸腺內(nèi)細胞類型的空間分布變化有關(guān)。

通常，T 細胞發(fā)育和成熟沿著胸腺小葉內(nèi)的 C-MC-M 軸發(fā)生（C：皮質(zhì)區(qū)域；M：髓質(zhì)區(qū)域；MC：髓質(zhì)-皮質(zhì)邊界）。為了準確識別這些區(qū)域進而深入了解不同細胞類型在 T 細胞發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用。研究者開發(fā)了 TSO-his算法對胸腺切片進行空間分區(qū)的結(jié)果，揭示了不同細胞類型在皮質(zhì)-髓質(zhì)（C-MC-M）軸上的空間分布。結(jié)果顯示，未成熟的T細胞（如DN_early和DP_blast）主要集中在皮質(zhì)區(qū)，而成熟的T細胞（如CD4+ T和CD8+ T細胞）則集中在髓質(zhì)區(qū)。此外，基質(zhì)細胞如成纖維細胞（Fb）和內(nèi)皮細胞（Endo）在髓質(zhì)區(qū)富集，表明這些細胞類型在調(diào)控T細胞發(fā)育中的重要作用。

通過分析八例胸腺樣本，研究者共識別出1885個顯著差異表達基因，這些基因在皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域表現(xiàn)出不同的空間分布特征。通過對胸腺不同解剖區(qū)域中顯著差異表達的基因（DVGs）的空間分布及其功能富集分析，進一步揭示了其在T細胞選擇和發(fā)育中的功能。后續(xù)研究者使用TSO-his確定了前五個在皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域顯著上調(diào)的基因，如CCL19和CCR7。CCL19是髓質(zhì)中zui顯著上調(diào)的基因，并在mTECs中特異性表達，而其配體CCR7在成熟T細胞中高水平表達，這些基因協(xié)同作用促進了成熟T細胞從胸腺遷移至外周。此外，ELOVL4和CD99的表達在皮質(zhì)區(qū)顯著升高，特別是在DP階段，表明其在雙陽性T細胞的TCRα鏈重排和陽性選擇過程中具有關(guān)鍵作用。

緊接著研究者分析揭示了在雙陽性重排（DP_re）階段，ELOVL4和CD99基因表達的富集，并且這與它們相應(yīng)的RNA表達譜結(jié)果一致。通過小鼠的基因敲除實驗，研究者發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ELOVL4缺失導(dǎo)致CD4+ T細胞數(shù)量顯著減少，并且有趣的是，ELOVL4的缺乏導(dǎo)致細胞因子(包括白細胞介素2 (IL-2)和干擾素-γ (IFN-γ))的產(chǎn)生減少，同時在受TCR + CD28刺激的這些T細胞的增殖能力受到抑制。相比之下，這一現(xiàn)象在CD99-KO骨髓中未觀察到，表明ELOVL4在CD4+ T細胞發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

實驗動物作為生命科學研究中的重要載體之一，在很多領(lǐng)域的科學研究中，充當著非常重要的安全試驗、效果試驗、標準試驗的角色，尤其在藥物有效性和安全性評價中發(fā)揮著不可huo缺的作用。

達為科生物投資建立的動物實驗中心，擁有清潔級、SPF級動物實驗室，面積約1800平米，中心員工包括獸醫(yī)、技術(shù)員和動物飼養(yǎng)員，所有員工擁有實驗動物上崗證，有著深厚的專業(yè)背景和豐富的實驗操作經(jīng)驗，可獨立開展包括大小鼠、裸鼠、豚鼠、兔、比格犬、羊、小型豬等常見實驗動物的動物飼養(yǎng)、造模及相關(guān)實驗。

    接下來研究者通過TSO-hismap工具，將scRNA-seq數(shù)據(jù)精確映射到空間轉(zhuǎn)錄組學坐標，生成胸腺的單細胞分辨率空間圖譜。并且與其他工具（如Seurat坐標轉(zhuǎn)換(SrtCT)、CellTrek和CARD）相比，發(fā)現(xiàn)TSO-hismap在區(qū)分皮質(zhì)和髓質(zhì)細胞類型方面表現(xiàn)出更高的精確性。同時進一步測量了不同細胞類型與髓質(zhì)中心的相對距離，揭示了未成熟T細胞（如DP_blast）主要集中在皮質(zhì)區(qū)，而成熟T細胞和mTEC則在髓質(zhì)區(qū)富集。這些結(jié)果表明，TSO-hismap工具能夠準確捕捉胸腺中不同細胞類型的空間分布，并揭示其在T細胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用。

后續(xù)研究者通過使用TSO-hismap以單細胞分辨率分割斑點來評估不同細胞類型的共定位程度。首先展示了 cTECs高度集中在近端皮質(zhì)-髓質(zhì)交界處和血管周圍，并與某些DP_re細胞強烈共定位。還觀察到Fb細胞富集在血管周圍的皮質(zhì)區(qū)域，并與cTEC共定位。這一發(fā)現(xiàn)提供了它們參與T細胞分化的潛在證據(jù)。同時，在髓區(qū)觀察到mTEC與CD 4 + T和CD 8 + T細胞的強共定位。另外，CD 8aa細胞在髓質(zhì)-皮質(zhì)邊界附近富集，還顯示出與記憶細胞以及Mono細胞的顯著共定位。同時免疫熒光染色進一步證實了這些細胞的共存，然而，這些細胞與CD8aa細胞之間相互作用的性質(zhì)仍不清楚，需要進一步探索。此外研究者還展示了從遠端皮質(zhì)到內(nèi)部髓質(zhì)，人類T細胞發(fā)育不同階段的胸腺細胞類型的空間共定位示意圖。

接下來研究者使用了常規(guī)標記基因繪制不同階段的細胞類型來重建T細胞的發(fā)育路線。通過結(jié)合胸腺TCR-seq、scRNA-seq和ST-seq數(shù)據(jù)觀察到TCR克隆大小≥3的T細胞通常富集在髓質(zhì)區(qū)域，而克隆大小為1的T細胞主要在皮質(zhì)區(qū)域。并且揭示了四種占優(yōu)勢的TCRγ-T細胞亞群，同時使用單細胞數(shù)據(jù)分析證實了這四個T細胞亞群的存在。然后研究者使用TSO-Hismap追蹤胸腺ST切片上四個T細胞亞群的空間定位，顯示了從遠端皮質(zhì)到髓質(zhì)中心點的四個T細胞亞群的定位趨勢，測量了四種T細胞亞群的代表區(qū)域到髓質(zhì)中心的距離。進一步還分析了每個亞組的六個zui顯著富集的生物過程以及不同年齡組的四種T細胞亞群豐度的動態(tài)變化。這些結(jié)果對了解其生物學過程和發(fā)育特征具有很高的價值。

鑒于T細胞發(fā)育與TCR庫以及TCR多樣性之間的密切關(guān)系，研究者觀察到TCRα和TCRβ鏈的四種T細胞亞群中VJ基因表達的明顯偏差，并且展示了VJ基因在四種T細胞亞群中的偏好性。由于αβ T細胞成熟是一個跨越多個中間狀態(tài)的連續(xù)分化過程，研究者基于RNA速度，特別是TRAV基因的特征評分，將DP_re細胞重新聚類為4個亞組進行分析。為了更系統(tǒng)地了解αβT細胞的分化模式，對所有T細胞進行了偽時間分析，分析了在T細胞分化偽時間內(nèi)的代表性基因并且展示了不同階段T細胞數(shù)量的累積分布曲線。隨后，努力追蹤這些克隆細胞的命運，揭示了這些細胞在各階段du特而連貫的發(fā)育軌跡。最后總結(jié)了四種T細胞亞群的發(fā)育時間和特征，以描述αβ T細胞的發(fā)育。

研究結(jié)論：

    本研究通過整合空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞多組學分析，揭示了人類胸腺細胞的空間組織和發(fā)育過程。研究者開發(fā)了TSO-his算法來確定胸腺切片中的髓質(zhì)-皮質(zhì)區(qū)域，劃分胸腺小葉，并測量基因表達或細胞豐度隨空間距離的變化。通過這種方法，研究人員能夠精確地描繪出胸腺小葉的結(jié)構(gòu)單元，并觀察到胸腺細胞類型簽名分數(shù)隨空間距離的動態(tài)變化。此外，研究還識別了與空間距離顯著共變的基因（DVGs），并利用CellChat工具分析了胸腺細胞亞群間的細胞間通信。這些發(fā)現(xiàn)為理解胸腺細胞的發(fā)育和功能提供了新的視角。

研究的創(chuàng)新性：

    本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在幾個方面：首先，研究者開發(fā)了TSO-his算法，這是一種新的方法，可以精確地在空間轉(zhuǎn)錄組學切片中確定髓質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)域，以及劃分胸腺小葉。其次，該研究整合了空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞多組學數(shù)據(jù)，提供了胸腺細胞發(fā)育的全面視圖。最后，研究不僅識別了與空間距離顯著共變的基因，還分析了胸腺細胞亞群間的細胞間通信，這為理解胸腺細胞的復(fù)雜相互作用提供了新的工具和數(shù)據(jù)。

研究的不足之處：

    文章中并未明確指出研究的不足之處，但根據(jù)研究內(nèi)容推測，可能的不足包括：樣本數(shù)量可能有限，這可能影響結(jié)果的普適性；研究主要依賴于算法和計算模型，可能需要更多的實驗驗證來支持算法的準確性；此外，研究主要集中在胸腺細胞的空間組織和發(fā)育，對于胸腺細胞功能和免疫應(yīng)答的深入機制探討可能不足，未來研究可以進一步探索這些方面。

研究展望：

    后續(xù)可能的研究方向包括：擴大樣本量，以增強研究結(jié)果的統(tǒng)計力和普適性；進行更多的實驗驗證，以確認TSO-his算法的準確性和可靠性；深入探討胸腺細胞的功能和免疫應(yīng)答機制，特別是在不同疾病狀態(tài)下胸腺細胞的作用；此外，可以探索胸腺細胞亞群間的細胞間通信在免疫發(fā)育中的具體作用，以及這些通信如何影響胸腺細胞的成熟和分化。

研究意義：

    本研究的理論意義在于提供了一種新的方法來分析胸腺細胞的空間組織和發(fā)育，這對于理解胸腺的免疫功能和胸腺細胞的成熟過程至關(guān)重要。實踐意義方面，這些發(fā)現(xiàn)有助于開發(fā)新的免疫治療方法，尤其是在胸腺相關(guān)疾病和免疫缺陷的治療中。此外，通過揭示胸腺細胞亞群間的通信網(wǎng)絡(luò)，本研究為設(shè)計針對特定免疫細胞的靶向治療策略提供了理論基礎(chǔ)。